Il Progetto ed il Meeting
Strategie terapeutiche per la sindrome di Dravet:
incremento della espressione del gene SCN1A
e modulazione delle alterazioni secondarie (rimodellamento patologico)
l progetto SCN1A-UP!, coordinato dal dottor Massimo Mantegazza e finanziato da EJPRD 2020, è una ricerca collaborativa realizzata da un Consorzio che coinvolge sei gruppi di ricerca europei e cinque associazioni di pazienti, tra cui il Gruppo Famiglie Dravet
L’obiettivo di SCN1A-UP! è di effettuare studi pre-clinici per lo sviluppo di terapie più efficaci per la DS , mirando alla perdita di funzione di SCN1A, la causa primaria della malattia, e al rimodellamento patologico che può svilupparsi in fasi successive, concetti terapeutici che potrebbero essere applicati anche ad altre malattie.
I risultati del progetto saranno presentati e discussi durante il Meeting finale che si terrà a Roma il 10 settembre 2024.
Di seguito una descrizione più ampia degli obiettivi e del disegno dello studio.
Il Consorzio
Il Consorzio Europeo SCN1A-UP! è stato finanziato dal Programma European Joint Programme on Rare Diseases (EJPRD) ed è formato da 6 gruppi di ricerca Europei coordinati dai seguenti ricercatori:
- Mantegazza, Massimo (Coordinatore del Consorzio)
Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) [Francia] - Broccoli, Vania
Ospedale San Raffaele [Italia] - de Witte, Peter
University of Leuven [Belgio] - Nadif Kasri, Nael
Radboud University [Paesi Bassi] - Hedrich-Klimosch, Ulrike
University of Tübingen [Germania] - Aronica, Eleonora
University of Amsterdam [The Netherlands]
Nel progetto sono anche coinvolte le seguenti associazioni di pazienti:
- Gruppo Famiglie Dravet APS [Italia]
- Alliance Syndrome de Dravet (ASD) [Francia]
- Associazione Italiana sindrome di Dravet [Italia]
- Dravet-Syndrom e.V. [Germania]
- Stichting Dravetsyndroom [Paesi bassi e Fiandre
Obiettivo del progetto
L’obiettivo del progetto è quello di sviluppare terapie innovative per la sindrome di Dravet.
In particolare, il Consorzio realizza studi preclinici con il proposito di scoprire trattamenti efficaci per prevenire o modificare la malattia.
Successivamente, per rendere disponibili ai pazienti queste terapie innovative saranno necessarie ulteriori valutazioni cliniche sull’uomo (sperimentazione clinica), che non rientrano nell’ambito delle attività del Consorzio.
Le malattie genetiche causano disfunzioni che sono direttamente indotte dalla variante (mutazione) genetica patogena 1️⃣ (che causa la malattia). Nel caso della sindrome di Dravet, le varianti patogene del gene SCN1A provocano la perdita di funzione del canale del sodio NaV1.1, con conseguente ipoeccitabilità (attività ridotta) dei neuroni GABAergici. La funzione dei neuroni GABAergici, che sono presenti in tutte le aree cerebrali, è quella di ridurre e/o regolare l’eccitabilità delle reti neuronali.
Le disfunzioni iniziali del gene SCN1A, indotte direttamente dalla mutazione genetica, possono generare diversi tipi di risposte (modifiche) secondarie2️⃣ (rimodellamenti) dell’organismo:
- alcune che amplificano le modificazioni patologiche dovute alle varianti del gene SCN1A, peggiorando quindi i sintomi della malattia (rimodellamento pro-patologico)
- altre che tendono a contrastare tali modificazioni patologiche migliorando quindi i sintomi della malattia (rimodellamento omeostatico).
Il gruppo di ricerca ipotizza che queste modifiche secondarie siano dovute alle risposte di (mal)adattamento del cervello al malfunzionamento del gene SCN1A e che le stesse modifiche secondarie possano contribuire a determinare le caratteristiche cliniche (gravità dei sintomi) della sindrome di Dravet.
Secondo questa ipotesi, in un approccio politerapeutico, potrebbe essere di beneficio ai pazienti trattare non solo il malfunzionamento del gene SCN1A ma anche le menzionate risposte secondarie con l’obiettivo di inibire le risposte pro-patologiche (a) e amplificare le risposte omeostatiche (b).
1️⃣ Condizioni anatomiche o fisiologiche anomale che portano a una malattia.
2️⃣ La risposta secondaria tende a ristabilire le condizioni normali di un organo, in modo da mantenere uno stato di equilibrio tra tutti i sistemi corporei necessari alla sopravvivenza e al corretto funzionamento dell’organismo.
Il disegno progettuale
l progetto SCN1A-UP! analizza e indirizza tutti questi aspetti. In tal senso il gruppo di ricerca sta attualmente valutando due strategie terapeutiche distinte:
1) ridurre le disfunzioni iniziali del gene SCN1A
2) ridurre il rimodellamento pro-patologico e migliorare il rimodellamento omeostatico, entrambi causati dalle risposte secondarie
1) ridurre le disfunzioni iniziali del gene SCN1A
Questa strategia mira a trattare direttamente la causa iniziale della malattia, che è la perdita di funzione del gene SCN1A (causa della insufficiente produzione della proteina NaV1.1.) Utilizzando metodi di terapia genica, il gruppo di ricerca mira selettivamente e fisicamente al gene SCN1A per aumentare la sua trascrizione3️⃣ naturale, al fine di aumentare l’espressione4️⃣ genica e, in ultima analisi, la quantità di proteina NaV1.1 prodotta dalle cellule. L’obiettivo è quindi quello di “curare” la perdita di funzionalità del gene SCN1A ripristinando i normali livelli di proteina NaV1.1 funzionale. A tal fine i ricercatori stanno sviluppando due terapie geniche specifiche che dovranno essere veicolate (somministrate) con vettori virali.
La prima terapia genica sfrutta il sistema CRISPR-Cas95️⃣ , utilizzando una versione modificata (nota come CRISPR-ON o CRISPR attivante, CRISPRa) che permette di controllare l’espressione genica con elevata specificità legandosi alle aree regolatrici6️⃣ (promotori) del gene SCN1A per aumentarne la trascrizione, con l’obiettivo finale di aumentare la produzione di proteina NaV1.1.
Il metodo si basa sulla consegna, con vettori virali, di materiale genetico che porta all’espressione nelle cellule di proteine batteriche modificate in grado di aumentare la trascrizione genica e di una molecola di RNA (denominata gRNA) che permette l’interazione specifica di queste proteine con le aree regolatorie di SCN1A.
I ricercatori hanno testato il metodo in colture di neuroni neocorticali di topo e di neuroni umani derivati da cellule staminali pluripotenti indotte, osservando un robusto incremento della trascrizione di SCN1A e dei livelli di NaV1.1. Tuttavia, l’efficacia osservata nel topo (in vivo ) è bassa perché gli elementi da somministrare sono grandi ed è difficile inserirli nei piccoli vettori virali (AAV) attualmente utilizzati per somministrare la terapia genica. Il gruppo di ricerca sta quindi ottimizzando il sistema per ridurne le dimensioni.
Parallelamente, i ricercatori stanno sviluppando un secondo strumento che utilizza piccoli domini di proteine di mammifero: un dominio chiamato Zinc-finger che si lega selettivamente alle aree regolatorie di SCN1A, fuso insieme a un dominio proteico chiamato VP64, che è un attivatore della trascrizione del gene. Questo strumento è molto più piccolo di CRISPR-ON (il primo strumento presentato sopra) e può essere inserito direttamente in vettori virali AAV per essere somministrato al paziente. Il gruppo di ricerca lo ha già convalidato in colture cellulari, osservando un ottimo aumento della trascrizione di SCN1A e dei livelli di NaV1.1. Stanno ora valutando l’effetto in vivo in modelli di topo e negli altri modelli sperimentali del consorzio SCN1A-UP!
3️⃣ La trascrizione è il processo di creazione di una copia di RNA della sequenza di DNA di un gene. Questa copia, chiamata RNA messaggero (mRNA), trasporta le informazioni proteiche del gene codificate nel DNA. Lo scopo della trascrizione è quello di produrre una copia di mRNA di un gene, per consentire alle informazioni genetiche di uscire dal nucleo, attraverso i pori nucleari, dove possono essere utilizzate per assemblare una proteina.
4️⃣ L’espressione genica è il processo attraverso il quale l’informazione codificata in un gene viene trasformata in una funzione (la proteina del canale del sodio NaV1.1 nel caso del gene SCN1A). Ciò avviene principalmente attraverso la trascrizione di molecole di RNA che codificano per le proteine (o di molecole di RNA non codificante che svolgono altre funzioni).
5️⃣ Il sistema CRISPR/Cas-9 è costituito da due elementi: l’RNA guida (gRNA) utilizzato per localizzare (legare) il DNA bersaglio a cui indirizzare il secondo elemento, la proteina Cas-9, che può tagliare o modificare il DNA nella posizione identificata dall’RNA guida o interagire con altri elementi endogeni che possono modulare (ad esempio, aumentare) l’espressione di un gene
6️⃣ Il DNA contenuto in una cellula porta con sé le informazioni necessarie allo svolgimento di una grande quantità di funzioni metaboliche. Queste funzioni non sono sempre necessarie, in ogni momento quindi la cellula “decide” quali geni esprimere e quali no a seconda delle diverse esigenze. I geni espressi in ogni circostanza sono detti geni costitutivi, gli altri sono definiti geni regolati.
2) ridurre il rimodellamento pro-patologico e migliorare il rimodellamento omeostatico, entrambi causati dalle risposte secondarie
La seconda strategia prevede l’identificazione delle modifiche secondarie (rimodellamento pro-patologico e omeostatico) derivanti dalla risposta dell’organismo alla variante genetica SCN1A causativa e che sono suscettibili di intervento terapeutico.
Nell’ambito di questa strategia il consorzio sta portando avanti due diversi approcci.
Il primo approccio studia il rimodellamento dei livelli di espressione di altri geni. Nello specifico, attraverso l’analisi delle informazioni genetiche ottenute da un modello di zebrafish (pesciolino) della sindrome di Dravet, il gruppo di ricerca ha identificato i geni (disregolati) con funzionamento alterato implicati nel rimodellamento che deriva dalla perdita di funzione di
SCN1A. Queste scoperte sono utilizzate come input per eseguire analisi computazionali finalizzate ad identificare nuovi farmaci candidati in grado di contrastare il rimodellamento pro-patologico (peggiorativo dei sintomi della malattia) identificato.
Tra i candidati farmaci sono anche presi in considerazione alcuni farmaci riposizionati (farmaci già esistenti utilizzati per nuovi scopi terapeutici, che possono quindi avere un rapido potenziale traslazionale ed essere resi disponibili ai pazienti più rapidamente).
Il lavoro svolto dai ricercatori prevede anche il confronto del rimodellamento dell’espressione genica osservato nei diversi modelli sperimentali disponibili, compreso quello nei modelli murini per i quali hanno già identificato possibili bersagli per l’intervento terapeutico. Il gruppo di ricerca ha testato alcuni farmaci candidati nello zebrafish, e ora li sta convalidando su modelli murini.
In un secondo approccio parallelo, sono stati eseguiti studi funzionali (valutazione delle proprietà dei neuroni in modelli murini) per rivelare le risposte secondarie.
In questo caso è stata identificata una risposta omeostatica (migliorativa dei sintomi della malattia) che i ricercatori intendono potenziare tramite un approccio terapeutico (in questo ambito il gruppo di ricerca ha già ottenuto risultati promettenti nei trattamenti cronici dei topi: riduzione delle crisi epilettiche e della mortalità, miglioramento dei deficit comportamentali/cognitivi senza segni di tossicità).
Tutte le strategie di trattamento identificate nel progetto sono attualmente in fase di valutazione utilizzando vari modelli sperimentali di sindrome di Dravet, tra cui modelli di zebrafish e di topo, neuroni umani derivati da cellule staminali pluripotenti indotte e colture di parti di cervello umano. L’ampio spettro di modelli sperimentali preclinici all’interno di una pipeline consolidata è uno dei punti di forza del progetto SCN1A-UP! Sfruttando questa pipeline, si potrà procedere a un’accurata convalida delle terapie candidate, tra cui l’efficacia dei farmaci e l’ottimizzazione del loro dosaggio.